PhagoCyt جداسازی فاگوزوم‌های حاوی سالمونلا و نقشه‌برداری از میزبان و بازسازی باکتریایی تورفتگی داخل سلولی را امکان‌پذیر می‌سازد.

جداسازی فاگوزوم های حاوی باکتری با استفاده از مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس بدون آنتی بادی (FACS)

ما یک روش قوی مبتنی بر فلوسیتومتری برای جداسازی فاگوزوم‌های حاوی پاتوژن ایجاد کردیم که آن را PhagoCyt نامیدیم. این رویکرد قدرتمند، جداسازی جمعیت های فاگوزومی بسیار خالص را امکان پذیر می کند که می توانند با استفاده از تکنیک های پروتئومی فوق حساس برای مشخص کردن پروتئوم های فاگوزومی و پاتوژن های داخل فاگوزومی تجزیه و تحلیل شوند (شکل 1A).

میکروب‌ها را می‌توان با بیان پروتئین‌های فلورسنت یا با استفاده از رنگ‌آمیزی سلول زنده مانند CellTrace Violet (CTV) نشان‌گذاری کرد که امکان بررسی جدایه‌های بالینی اصلاح‌نشده ژنتیکی را فراهم می‌کند (شکل S1A). نکته مهم این است که رنگ آمیزی CTV بر جذب فاگوسیتی تأثیر نمی گذارد (شکل S1B). ما استراتژی دروازه‌بندی را برای فاگوزوم‌های باکتریایی با اندازه اول بهینه کردیم (شکل 1B و S1D). غشاهای فاگوزومی در لیزات ماکروفاژها، ما 4 میکرومولار CellVue Claret Far Red (CCFR) را به عنوان بهینه شناسایی کردیم، که اجازه حذف باکتری‌هایی را که به سادگی به قطعات غشاء متصل هستند را می‌دهد (شکل S1C). نکته مهم این است که CCFR غشاهای باکتریایی را رنگ آمیزی نمی کند و برچسب خاصی را برای ساختارهای فاگوزومی مشتق از میزبان ارائه می دهد (شکل 1B و S1E).

سلول‌های THP-1 انسانی با استفاده از 10 نانوگرم در میلی‌لیتر فوربول-12-میریستات-13-استات (PMA) به ماکروفاژها تمایز داده شدند، که منجر به بیان سطح بالایی از نشانگرهای ماکروفاژی CD11b، CD11c، و CD14 شد (شکل S2A-S2E). این ماکروفاژها سپس با پروتئین فلورسنت آبی (BFP) -expressing آلوده شدند. سالمونلا تیفی موریوم در تعدد عفونت (MOI) 1:100 به مدت 30 دقیقه و سلول های آلوده تا 4 ساعت در محیط حاوی جنتامایسین نگهداری شدند.

بیان BFP در STM بر رشد و بقای باکتری تأثیری نداشت (شکل S1F و S1G). از آنجایی که عفونت STM باعث مرگ سلولی ماکروفاژ در مقاطع زمانی بعدی شد (بعد از 4 ساعت استفاده در اینجا) [12]مراحل سانتریفیوژ برای اطمینان از اینکه اکثر ماکروفاژهای زنده پلت شده بودند گنجانده شد.

ماکروفاژهای زنده و آلوده به صورت مکانیکی با استفاده از هموژنایزر Dounce لیز شدند و سلول ها و هسته های دست نخورده با سانتریفیوژ حذف شدند. فاگوزوم ها سپس با سانتریفیوژ از این مایع رویی پس از هسته ای گلوله شدند، غشاها با CCFR رنگ آمیزی شدند و با فلوسیتومتری آنالیز شدند. این فاگوزوم های دو مثبت، باکتری های حاوی و غشاهای رنگ آمیزی شده با CCFR را نشان داد. آزمایشات کنترل (شکل 1B) نشان می دهد که باکتری های رنگ نشده (سیاه) با BFP نشاندار شده اند. سالمونلا به تنهایی (آبی)، با برچسب BFP سالمونلا تیمار شده با CCFR (بنفش) و لیزات سلولی حاوی فاگوزوم c سالمونلا بدون بیان BFP (قرمز) سیگنال های مثبت دوگانه تولید نمی کند. فقط BFP-expression سالمونلا در فاگوزوم یک سیگنال مثبت دوگانه (سبز) نشان می دهد. سیتومتری تصویر خلوص 95% و غشاهای فاگوزومی سالم را تایید کرد (شکل 1C).

با فرض اینکه یک سلول ماکروفاژ دارای قطر 10 میکرومتر و میانگین جرم پروتئین 230 pg است. [13]و یک فاگوزوم 1 میکرومتری یک فاگوزوم منفرد حاوی حدود 0.1٪ از محتویات / حجم سلول (~0.23 pg پروتئین)، 10 است.⁵ فاگوزوم ها تقریباً 23 نانوگرم پروتئین دارند. ما آماده‌سازی نمونه را برای این نمونه‌های کم ورودی با استفاده از روش S-Trap با بازیابی بالا برای لیز سلولی و تخریب پروتئین بهینه کردیم. برای بهبود حساسیت پروتئومیکس، ما همچنین پارامترهای diaPASEF را روی ابزار timsTOF HT بهینه کردیم (شکل 1D). به طور خاص، ما تعدادی طرح اکتساب diaPASEF با عرض متغیر با استفاده از pydiAID طراحی کردیم. [14] و آنها را با بارهای پپتید تریپتیک بهینه و کم آزمایش کرد. آزمایش 500 نانوگرم هضم لیزات پروتئین HeLa در دسترس تجاری با گرادیان 60 دقیقه، بیش از 8000 شناسه گروه پروتئینی (شناسه‌های منحصربه‌فرد) و بیش از 120،000 پیش‌ساز با طرح بهینه 16 پنجره (W) diaPASEF بدست آورد. در حالت با حساسیت بالا، timsTOF HT 6000-7000 شناسه گروه پروتئینی و 60000 پیش ساز را از 25 تا 50 نانوگرم لیزات HeLa هضم شده شناسایی کرد (شکل 1E).

با استفاده از این گردش کار، ما آنالیز پروتئومی فاگوزوم های جدا شده از ماکروفاژهای THP-1 را انجام دادیم که با نوع وحشی بیانگر BFP (WT) آلوده شده بودند. سالمونلا تیفی موریوم (STM) و ΔphoP جهش یافته قادر به پاسخگویی به محیط خصمانه فاگوزومی نیست [3]برای هر شرایط، ماکروفاژها در MOI 1:100 به مدت 30 دقیقه به چالش کشیده شدند و به دنبال آن تیمار جنتامایسین برای از بین بردن باکتری های خارج سلولی انجام شد. سپس ماکروفاژها به مدت 30 دقیقه یا 4 ساعت تعقیب شدند تا نمونه‌هایی از فاگوزوم‌ها در نقاط زمانی اولیه / اواسط و اواخر / بالغ تولید شوند.

بلوغ فاگوزوم های WT STM برهمکنش های پیچیده با اندامک ها و کمپلکس های پروتئینی را نشان می دهد

بلوغ فاگوزوم شامل یک تعامل پویا با اندامک های میزبان و کمپلکس های پروتئینی است [1]در شش تکرار بیولوژیکی، PhagoCyt علیرغم جداسازی در روزهای مختلف (شکل S3A-S3C) و جداسازی واضح شرایط فردی (شکل S3D) تکرارپذیری بسیار بالایی از خود نشان داد. به طور کلی، ما 5800 پروتئین را شناسایی کردیم که از این تعداد 4625 پروتئین انسانی و 1175 پروتئین STM و 1175 پروتئین STM از کل S531. پروتئین ها به طور قابل توجهی در طول بلوغ فاگوزوم در فاگوزوم های STM WT به وفور تغییر کردند (r  1.5)، با 858 انسان و 444 سالمونلا پروتئین ها افزایش یافت در حالی که 557 انسان و 15 سالمونلا پروتئین ها کاهش یافت (شکل 2A).

شکل 2. نتایج پروتئومیکس برهمکنش پیچیده فاگوزوم ها با اندامک های میزبان را نشان می دهد.

(الف) نمودار آتشفشانی STM WT 4 ساعت در مقابل داده های پروتئومی 30 دقیقه (داده های زیربنای این شکل را می توان در جدول S6 یافت). (ب) تجزیه و تحلیل GO-term اندامک های شناسایی شده در فاگوزوم های STM. (C) نقشه حرارتی پروتئین های میتوکندری شناسایی شده تغییرات قابل توجهی را در پروتئین های میتوکندریایی در طول زمان و درون سویه های باکتریایی آزمایش شده نشان می دهد (داده های زیربنایی این شکل را می توان در جداول S5 و S6 یافت). (د) درمان ماکروفاژهای آلوده به STM به مدت 4 ساعت با 2 میکرومولار از روتنون مهارکننده کمپلکس میتوکندری I، بقای STM را کاهش داد، احتمالاً به دلیل افزایش تولید ROS (n = 4). (E) روتنون هیچ تاثیری بر باکتری های موجود در آبگوشت LB نداشت (رشد 4 ساعته، ص = 3). ** = ص 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3004073.g002

پروتئوم های فاگوزومی برای پروتئین های تاولی، اندوزومی و لیزوزومی، همراه با پروتئین هایی از شبکه آندوپلاسمی، میتوکندری ها و پروتئین های پوشش هسته ای غنی شده بودند (شکل 2B). پروتئین‌های ER و برخی از پروتئین‌های میتوکندری نیز بر روی فاگوزوم‌های مهره‌ای پلی استایرن بی‌صدا شناسایی شدند. [15]. با این حال، در حالی که استخدام غشای ER برای فاگوزوم های STM شناخته شده است [11]شناسایی پروتئین‌های میتوکندری در فاگوزوم‌های حاوی باکتری در انتشارات قبلی به عنوان یک آلاینده در نظر گرفته شد، به‌ویژه زمانی که با اولتراسانتریفیوژ جدا شد. [9]، به دلیل تراکم مشابه میتوکندری ها و باکتری ها. با این حال، جداسازی مبتنی بر FACS ما به شیب چگالی متکی نیست. علاوه بر این، فراوانی پروتئین میتوکندری بین شرایط متفاوت است (شکل 2C)، که نشان می‌دهد میتوکندری‌ها ممکن است به‌جای اینکه به‌عنوان آلاینده‌های غیرفعال حضور داشته باشند، به طور فعال به فاگوزوم‌ها وارد شوند. در واقع، جداسازی فاگوزوم‌های حاوی STM توسط اولتراسانتریفیوژ، 6166 پروتئین انسانی را شناسایی کرد (جدول S8؛ شکل S6A) و شامل پروتئین‌های بیشتری از تقریباً هر اندامک سلولی بود (شکل S6B).

STM چندین پروتئین مؤثر ترشح می کند که میتوکندری را تغییر می دهد [16,17]. از آنجایی که گونه های اکسیژن فعال میتوکندری (ROS) نشان داده شده است که در تخریب پاتوژن ها در فاگوزوم ها نقش دارند. [18] نشان داده شده است که غشاهای تولیدکننده ROS میتوکندری از طریق وزیکول های مشتق شده از میتوکندری (MDVs) به فاگوزوم های حاوی باکتری تحویل داده می شوند. [19]ما آزمایش کردیم که آیا مهار کمپلکس میتوکندری I، که تولید ROS را افزایش می‌دهد، تأثیری بر سالمونلا بقا یا تکثیر در واقع، مهار کمپلکس I توسط روتنون افزایش یافته است سالمونلا به طور قابل توجهی کشته شدند (شکل 2D)، در حالی که درمان روتنون از سالمونلا خارج از سلول ها بر زنده ماندن یا رشد آنها در یک دوره زمانی مشابه تأثیری نداشت (شکل 2E). به طور کلی، این نشان می دهد که استخدام غشای میتوکندریایی به فاگوزوم یک مکانیسم دفاعی میزبان را نشان می دهد.

پروتئوم فاگوزومی STM به طور چشمگیری در طول بلوغ تغییر می کند

مقایسه فاگوزوم های 30 دقیقه و 4 ساعت STM WT نشان داد که چندین پروتئین در فاگوزوم های STM 4 ساعته از جمله ماتریکس متالوپروتئیناز 9 (MMP9) بسیار غنی شده اند. [20]که نقش کلیدی در بازسازی ماتریکس خارج سلولی ایفا می کند و در طول عفونت های باکتریایی لکوسیت ها را جذب می کند و فعال سازی سیتوکین، کموکاین و دفنسین را تسهیل می کند. [21]. جالب توجه است، مهار کننده آن، مهارکننده متالوپروتئیناز 3 (TIMP3) [22] به همان اندازه فراوان تر است. سایر پروتئین‌های تنظیم‌شده عبارتند از IFI30/GILT، یک تیول ردوکتاز لیزوزومی که در کاهش پیوند دی سولفید نقش دارد. Galectin-3 (LGALS3)، که برای فاگوسیتوز و ترمیم غشای فاگوزومی حیاتی است. [23,24]; و Gasdermin-A، پروتئین منافذی که می تواند با هدف قرار دادن ترجیحی غشای میتوکندریایی، پیروپتوز را القا کند. [25]. علاوه بر این، آلفا-ال-ایدورونیداز IDUA، که گلیکوزآمینوگلیکان ها را تجزیه می کند، تقریباً 4 برابر افزایش یافت و این احتمال را افزایش داد که در تجزیه قند سطحی باکتریایی نقش داشته باشد (شکل 3A).

شکل 3. انتخاب پروتئین ها و کمپلکس های پروتئینی در حال تغییر قابل توجه در فاگوزوم های WT STM

(A-E) شدت پروتئین log2 پروتئین های انتخاب شده در فاگوزوم های STM WT 30 دقیقه (آبی روشن) و WT 4 ساعت (آخر، آبی تیره) نرمال شده است. (F–J) میانگین شدت پروتئین نرمال شده log2 اعضای کمپلکس پروتئینی کمپلکس های پروتئینی منتخب. میانگین تغییرات log2 برابری (FC) از تفاوت log2 پروتئین های فردی محاسبه شد. اعداد در شکل نشان دهنده تغییرات log2 برابر هستند (همه داده های زیربنایی این شکل را می توان در جداول S3-S6 یافت) *: ص آزمون p p p t (FDR کنترل شده).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3004073.g003

همانطور که انتظار می رود، اکثر گیرنده های غشای پلاسمایی مانند گیرنده های Fc- و سیتوکین به طور قابل توجهی با بلوغ کاهش می یابند، چه از طریق بازیافت یا تخریب (شکل 3B). جالب توجه است که اینتگرین ها از این روند پیروی نکردند، زیرا برخی از اعضای خانواده اینتگرین به وفور کاهش یافتند در حالی که برخی دیگر در طول زمان افزایش یافتند (شکل 3C). به ویژه، ITGAL و ITGB2، که برای آنها حیاتی است سالمونلا ترخیص [26,27]، از جمله رو به رشد بودند. با توجه به نقش آنها در تنظیم اسکلت سلولی اکتین، جذب اینتگرین ممکن است به تنظیم دستگاه اسکلت سلولی اکتین بسیار پراکنده در اطراف فاگوزوم های STM کمک کند (شکل 3H). یک مشاهدات قابل توجه به خصوص افزایش قابل توجه گیرنده Toll مانند 2 (TLR2) در طول زمان بود (شکل 3D)، که با رفتار TLR2 در فاگوزوم های مهره ای که به طور معمول بالغ می شوند، در تضاد بود. [28]. این نشان می دهد که فاگوزوم های STM ممکن است مسیرهای سیگنالینگ مختلفی را در طول بلوغ درگیر کنند.

در مدل ساده شده بلوغ فاگوزومی، پروتئین های لیزوزومی مانند کاتپسین ها با بلوغ افزایش می یابد. در واقع، این پروتئازهای کلیدی لیزوزومی در درجه اول با بلوغ افزایش می‌یابند، اما مانند اینتگرین‌ها، همه اعضا آنطور که انتظار می‌رود رفتار نمی‌کنند، با چهار کاتپسین که در طول زمان کاهش می‌یابد (شکل 3E)، که نشان می‌دهد قاچاق به فاگوزوم STM از مخازن کاتپسین سلولی پیچیده است و به طور بالقوه توسط STM بازسازی می‌شود. [29]. در واقع، STM باعث مرگ سلول میزبان به دلیل قاچاق مجدد کاتپسین ها می شود [30].

چندین کمپلکس پروتئینی با بلوغ کاهش فراوانی نشان می‌دهند، از جمله سپتین‌ها که برای تشکیل فاگوزوم ضروری هستند، اما در تشخیص تقسیم سلولی باکتریایی در فاگوزوم‌ها نیز نقش دارند. [31,32] (شکل 3F)، کمپلکس کوتومر (پروتئین های COP) که پروتئین ها را از گلژی (شکل 3G) و اسکلت سلولی اکتین فوق الذکر (شکل 3H) منتقل می کند. برعکس، کمپلکس‌های پروتئینی که در طول بلوغ افزایش می‌یابند شامل پروتئازوم (شکل 3J) است که اخیراً نشان داده شده است که پپتیدهای ضد باکتری تولید می‌کند. [33] و همچنین پپتیدهای ارائه آنتی ژن. بر این اساس، مولکول های MHC نیز در طول بلوغ افزایش یافتند (شکل 3K).

این یافته‌ها تنظیم پیچیده بلوغ فاگوزومی را برجسته می‌کند و پویایی مورد انتظار و غیرمنتظره پروتئین‌هایی را که محیط فاگوزومی را شکل می‌دهند، آشکار می‌کند. سالمونلا عفونت

سالمونلا به طور فعال جذب پروتئین فاگوزومی را به روشی وابسته به PhoP تعدیل می کند

سالمونلا تیفی موریوم به طور فعال محیط فاگوزومی خود را با ترشح پروتئین های موثر، عمدتاً از طریق تغییر می دهد. سالمونلا جزایر بیماری زایی I و II (SPI-1/SPI-2) [4]. توانایی تشخیص محیط فاگوزومی اسیدی توسط PhoP برای القای SPI-2 T3SS و پروتئین های موثر ترشح شده مسئول بقا و تکثیر درون سلولی ضروری است. [3].

گونه های اکسیژن فعال (ROS) برای از بین بردن پاتوژن های داخل سلولی ضروری هستند. سلول میزبان با استفاده از سوپراکسید دیسموتازها که سوپراکسید را به H تبدیل می کند، با استرس اکسیداتیو مقابله می کند₂O₂. جالب توجه است، سوپراکسید دیسموتاز سیتوپلاسمی 1 (SOD1) تحت شرایط اندازه‌گیری شده تغییری نکرد. با این حال، SOD2 میتوکندری نه تنها به طور قابل توجهی در فاگوزوم فراوان‌تر بود، بلکه با بلوغ به طور قابل‌توجهی افزایش یافت، که نشانه‌ای از سطوح بسیار بالای ROS در فاگوزوم در حال بلوغ است (شکل 4A؛ جدول S7). این همچنین توسط القای سوپراکسید دیسموتازهای باکتریایی مانند SodCA (شکل 5B) پشتیبانی می شود. جالب توجه است، در حالی که کمپلکس NADPH اکسیداز (NOX) در فاگوزوم‌های WT STM کاهش می‌یابد، تولید ROS میتوکندری می‌تواند این کاهش را جبران کند، به‌ویژه زیرا سنتازهای اکسید نیتریک ناشی از اینترفرون (iNOS) در زمان‌های زمانی مورد تجزیه و تحلیل غیرقابل شناسایی بودند (شکل 4A).

شکل 4. تغییرات پروتئین انتخاب شده در فاگوزوم های جهش یافته phoP و مرده WT STM.

(الف) شدت پروتئین log2 نرمال شده پروتئین های انتخاب شده در تبدیل سوپراکسید و تولید گونه های اکسیژن فعال در فاگوزوم های اولیه (30 دقیقه) و اواخر (4 ساعت) از (زنده) WT STM و ΔphoP جهش یافته STM (ب) میانگین شدت پروتئین های نرمال شده log2 پروتئین های دخیل در گلیکولیز و گلوکوژنز. میانگین تغییرات log2 برابری (FC) از تفاوت log2 پروتئین های فردی محاسبه شد. (C) شدت پروتئین log2 نرمال شده پروتئین‌های انتخاب شده با تغییر قابل توجهی. اعداد در شکل نشان دهنده تغییرات log2 برابر هستند (همه داده های زیربنایی این شکل را می توان در جداول S3-S6 یافت). *: ص آزمون p p p t (FDR کنترل شده).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3004073.g004

شکل 5. تغییرات پروتئین باکتریایی انتخابی در WT STM در فاگوزوم ها.

(الف) شدت پروتئین log2 نرمال شده پروتئین های باکتریایی انتخاب شده القا شده در پایان (4 ساعت) سالمونلا فاگوزوم ها (داده های زیربنایی این شکل را می توان در جدول S6 یافت). (ب) آزمایش‌های عفونت در BMDMs STM WT و سویه‌های حذفی سه پروتئین باکتریایی جدید درگیر در عفونت. (C) شدت پروتئین log2 نرمال شده پروتئین های ردوکس باکتریایی و پروتئین های مونتاژ خوشه ای آهن-گوگرد (داده های زیربنایی این شکل را می توان در جداول S3-S6 یافت). (د) شدت پروتئین log2 نرمال شده پروتئین های باکتریایی انتخاب شده در پایان (4 ساعت) به وفور کاهش می یابد. سالمونلا فاگوزوم ها (داده های زیربنایی این شکل را می توان در جداول S3-S6 یافت). اعداد در شکل نشان دهنده تغییرات log2 برابر هستند. *: ص آزمون p p p t (FDR کنترل شده).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3004073.g005

گلیکولیز برای پاکسازی ماکروفاژها ضروری است سالمونلا تیفی موریوم [34]. علیرغم گزارش های قبلی که نشان می دهد STM فعالیت کلی گلیکولیتیک را در ماکروفاژهای آلوده کاهش می دهد [35]ما افزایش ارتباط پروتئین های گلیکولیتیک با فاگوزوم های بالغ را مشاهده کردیم. با این حال، این الگو در جهش PhoP معکوس شد و نشان می‌دهد که PhoP بازیافت متابولیک را در فاگوزوم تنظیم می‌کند (شکل 4B). این امر از کارهای قبلی حمایت می کند که نشان می دهد STM درون سلولی از متابولیت های میزبان به عنوان منابع کربن استفاده می کند [36].

به طور قابل توجهی، چندین پروتئین که با بلوغ در فاگوزوم های STM WT افزایش یافتند – از جمله MMP9، TIMP3، Galectin-3، و Gasdermin-A- روند مخالفی را در جهش PhoP نشان دادند (شکل 4C). معکوس مشابهی برای پروتئین های القا شده با اینترفرون، مانند ISG15، لیگاز آن HERC5، و IFI30/GILT مشاهده شد که با بلوغ در فاگوزوم های جهش یافته PhoP کاهش یافت. این نشان می‌دهد که ژن‌های وابسته به PhoP (از جمله عوامل SPI-2) به طور فعال محیط فاگوزومی را بازسازی می‌کنند و بر فرآیندهای ایمنی و متابولیک کلیدی تأثیر می‌گذارند.

PhagoCyt فرضیه های جدید را شناسایی می کند سالمونلا پروتئین های موثر

STM از سیستم PhoP/Q برای حس کردن pH پایین واکوئولی استفاده می‌کند، که باعث بیان پروتئین‌های مؤثر ترشح شده از طریق SPI-2 T3SS می‌شود. این افکتورها برای بقای باکتری و تکثیر در میزبان حیاتی هستند [37].

مطابق با مطالعات قبلی [3]ما القای قوی ژن‌های تنظیم‌شده با PhoP را در فاگوزوم‌های STM در نقطه زمانی 4 ساعت در مقایسه با فاگوزوم‌های 30 دقیقه‌ای مشاهده کردیم (شکل 5A). این شامل اجزای کلیدی سیستم PhoP/Q (PhoP، PhoQ، PhoN، PhoU، PhoB) و همچنین انتقال‌دهنده فسفات PstS، بخشی از مجتمع حمل‌ونقل ABC PstSACB است که توسط PhoB در پاسخ به گرسنگی فسفات فعال می‌شود. [38]. علاوه بر این، ما افزایش قابل توجهی در چسبندگی غشای خارجی و پروتئین Invasin PagN مشاهده کردیم که تطابق با سوله های میزبان داخل سلولی را تسهیل می کند. [39]و همچنین تنظیم وابسته به PhoP PagC، که در تشکیل وزیکول‌های غشای خارجی باکتری (OMVs) نقش دارد. [40,41]. در نهایت، افزایش قابل توجهی در PdgL (PcgL)، یک دی پپتیداز D-Ala-D-Ala پری پلاسمیک پیدا کردیم. شناسایی این پروتئین‌های مستند که از عفونت STM حمایت می‌کنند، رویکرد ما را تأیید می‌کند.

علاوه بر عوامل موثر شناخته شده، PhagoCyt چندین پروتئین فرضی را شناسایی کرد که در عفونت نقش دارند. در میان پروتئین‌هایی که در 4 ساعت تنظیم شد، SL1344_1263 (پروتئین خانواده لیپید A deacylase LpxR) بود. [42] که توسط HilD تنظیم می شود [43]، SL1344_1563، یک پروتئین پوشش سلولی پیش بینی شده، و SL1344_3560، یک فسفاتاز اسید فسفاتیدیک پیش بینی شده (شکل 5A). در حالی که نشان داده شده است که دو مورد اخیر به تشخیص عفونت در محیط روده در غربالگری ترانسپوزون کمک می کنند. [44]آزمایشات عفونت خودمان در BMDM نشان داد که حذف SL1344_1563 یا SL1344_1263 منجر به کاهش قابل توجهی در بقای درون سلولی در مقایسه با سویه WT شد. با این حال، از دست دادن SL1344_3560 اثر قابل توجهی نداشت (شکل 5B).

برای مقابله با سطوح بالای ROS تولید شده توسط سلول میزبان، STM به طور قابل توجهی فراوانی پروتئین های مهارکننده ROS، از جمله سوپراکسید دیسموتازهای SodCa و SodA، متیونین سولفوکسید ردوکتاز A (MsrA) و آلکیل هیدروپراکسید ردوکتاز AhpC را القا می کند. [45]. ما همچنین افزایش سطح پروتئین‌های خوشه‌ای آهن-گوگرد (Fe-S) (SufC، SufD، SufI و SufS) را مشاهده کردیم که از بقا در ماکروفاژها پشتیبانی می‌کنند. [46] و به عنوان تنظیم کننده های منفی قوی SPI-1 عمل می کند، در نتیجه به STM کمک می کند تا جایگاه مناسبی در سلول های میزبان ایجاد کند. [47] (شکل 5C).

در حالی که تعداد زیادی از پروتئین های باکتریایی در طول بلوغ فاگوزوم به وفور افزایش می یابد، تنها یک زیر مجموعه کوچکتر سطوح کاهش یافته را نشان می دهد. اینها عبارتند از FlgK، یک ژن تاژکدار که به محض ورود به سلول برای فرار از مسیرهای ایمنی ذاتی میزبان برای شناسایی اجزای تاژکدار مانند PAMPها تنظیم می شود. [48]. علاوه بر این، کاهش پروتئین های پیچیده تزریقی SPI-1 مانند SctB1 را مشاهده کردیم [49] و همچنین عوامل ارائه شده توسط SPI-1 مانند SipB، SopB و SopE، اعتبار ادبیات موجود را تأیید می کند. با این حال، ما همچنین پتانسیل جدیدی را شناسایی کرده ایم سالمونلا پروتئین‌های عفونت اولیه، از جمله مهم‌ترین پروتئین‌های مقاومت مس نامشخص YobA و لیپوپروتئین YbaY، که در تشکیل بیوفیلم نقش دارند، که هر دو در فاگوزوم‌های اولیه حدود 2 برابر فراوان‌تر بودند (شکل 5D).

این داده ها نشان می دهد که PhagoCyt ممکن است به عنوان یک ابزار قدرتمند برای شناسایی پروتئین های عامل میکروبی جدید پاتوژن های داخل سلولی عمل کند.

بیانیه اخلاق و موش

موش WT C57BL / 6J از رودخانه چارلز به دست آمد. تمام کارهای مربوط به حیوانات توسط کمیته اخلاق دانشگاه نیوکاسل تایید شد و دستکاری تحت مجوز پروژه دفتر خانه بریتانیا (PPL: PP9855950) به MT انجام شد. در این مطالعه از هیچ نمونه انسانی/ اهدایی استفاده نشد.

آنتی بادی ها

• ضد CD11b موش BUV737 (#612801، BD Biosciences).
• BUV737 موش IgG2b، کنترل ایزوتیپ κ (#612762، BD Biosciences).
• آنتی بادی مونوکلونال CD11c (N418)، APC (#17-0114-82، Invitrogen).
• همستر ارمنی IgG کنترل ایزوتیپ (eBio299Arm)، APC (#17-4888-82، Invitrogen).
• آنتی بادی مونوکلونال CD14 (61D3)، Alexa Fluor 700 (#56-0149-42، Invitrogen).
• کنترل ایزوتیپ کاپا IgG1 ماوس (P3.6.2.8.1)، Alexa Fluor 700 (#56-4714-80، Invitrogen).
• آنتی بادی ضد CD44 FITC (#338803، BioLegend).
• IgG1 موش FITC، آنتی بادی کنترل ایزوتیپ κ (#400107، BioLegend).
• Alexa Fluor 488 (AF488) آنتی بادی IgG ضد خرگوش بز (Invitrogen).

کشت سلولی THP-1 و تمایز به ماکروفاژها

رده سلولی لوسمی مونوسیتی انسانی THP-1 (TIB-202، ATCC) در محیط کشت RPMI-1640 (Gibco) حاوی 10% FBS و 4 میلی مولار L-گلوتامین در دمای 37 درجه سانتی گراد در CO 5% مرطوب شده کشت داده شد.₂ جو ATCC به طور معمول احراز هویت خط سلول را با استفاده از پروفایل تکرار پشت سر هم کوتاه انجام می دهد. آزمایشات سلولی همیشه در یک دوره زمانی که بیش از 20 پاساژ پس از احیا نبود انجام می شد و سلول ها به طور منظم برای مایکوپلاسما آزمایش می شدند.

برای تمایز سلول های THP-1 به ماکروفاژها، سلول های THP-1 را در غلظت 5 × 10 کشت دادیم.⁵ سلول در میلی لیتر با 10 نانوگرم در میلی لیتر فوربول 12-میریستات 13-استات (PMA) (سیگما-آلدریچ) به مدت 48 ساعت و به دنبال آن 24 ساعت با محیط تازه بدون PMA. این شرایط کشت با ارزیابی زنده ماندن سلولی و ایمونوفنوتیپ با استفاده از CD11b، CD11c، CD14 و CD44 بهینه شد (شکل S1). ما زنده ماندن سلولی را با رنگ آمیزی با یدید پروپیدیوم ارزیابی کردیم.

سویه های باکتریایی و شرایط کشت

سالمونلا انتریکا سرووار Typhimurium SL1344 و Δ مشتق شدهphoP جهش یافته (جدول S1) با مهربانی توسط Dirk Bumann (Biozentrum Basel) تهیه شد و در LB براث در دمای 37 درجه سانتی گراد با چرخش ثابت رشد کرد. تمام جهش‌یافته‌های دیگر با حذف ژن با استفاده از سیستم λ قرمز recombinase ساخته شدند [58] با اصلاحات [59] با استفاده از آغازگرهای شرح داده شده در جدول S2.

عفونت باکتریایی

برای هر تکرار آزمایشی، 4 × 10⁷ سلول های THP-1 به ماکروفاژها تمایز داده شدند، بذر 10×10⁷ سلول ها روی یک ظرف کشت بافت 150 میلی متری. قبل از عفونت، محیط سلولی با 10 میلی لیتر محیط کامل تازه سازی شد (قبل از تجدید محیط سه بار با PBS گرم شسته شد). کشت های باکتریایی یک شبه (چگالی نوری (OD600 نانومتر) 1.0-1.2، که در آن OD = 1 برابر است با 1 × 10⁹ باکتری در میلی لیتر)، دو بار در PBS گرم با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه شسته شدند و متعاقباً در محیط کشت سلولی گرم در MOI مورد نظر 100 در غلظت 10×10 مجدداً معلق شدند.⁹/ میلی لیتر. ورودی باکتری روی صفحات آگار LB برای شمارش واحدهای تشکیل دهنده کلونی (CFU) قرار داده شد. سپس باکتری ها در MOI 1:100 اضافه شدند و به مدت 30 دقیقه برای جذب انکوبه شدند. این منجر به زمان 30 دقیقه شد. پس از 30 دقیقه، محیط حاوی باکتری را حذف کردیم، دو بار با PBS گرم شسته شد و محیط را با 50 میکروگرم در میلی لیتر جنتامایسین تجدید کردیم. پس از یک ساعت، سلول‌ها مجدداً دو بار با PBS گرم شسته شدند و با محیط تازه حاوی 15 میکروگرم در میلی‌لیتر جنتامایسین تا 4 ساعت (4 ساعت پس از عفونت یا پس از عفونت) انکوبه شدند. CFUs با لیز کردن سلول ها در 0.1٪ Triton-X 100 در PBS در نقاط زمانی مشخص تعیین شد.

رنگ‌آمیزی باکتریایی با بنفش CellTrace (CTV)

قبل از عفونت، باکتری های بدون برچسب با غلظت های مختلف رنگ CellTrace Violet (CTV) (Thermo-Fisher Scientific) طبق پروتکل سازنده رنگ آمیزی شدند. غلظت بالاتر رنگ CTV آزمایش شده، 500 میکرومولار، 97 درصد از باکتری ها را رنگ آمیزی کرد و شدت فلورسانس آن با mTagBFP سازگار بود. علاوه بر این، رنگ CTV بر جذب باکتریایی تأثیری نداشت (شکل S2B). به طور خلاصه، OD₆₀₀ برای کشت شبانه و حدود 10 اندازه گیری شد⁹ باکتری ها در 500 میکرولیتر PBS گرم با رنگ آمیزی CTV 500 میکرومولار (برای رسیدن به رنگ آمیزی همگن بلافاصله مجدداً معلق شوند) به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس باکتری ها دو بار با PBS (در دمای 37 درجه سانتیگراد) به مدت 5 دقیقه شسته و به مدت 15 دقیقه با سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در نهایت، باکتری ها در محیط کشت سلولی گرم در MOI 100 معلق شدند.

لیز سلولی برای جداسازی فاگوزوم ها

پس از زمان مشخص شده (30 دقیقه جذب و 4 ساعت بعد از ظهر)، محیط حذف شد و PBS سرد یخ اضافه شد. سپس سلول ها از چهار ظرف خراشیده شدند، به لوله های 15 میلی لیتری منتقل شدند و در 300 سانتریفیوژ شدند.g در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه گلوله های سلولی دو بار با PBS سرد یخ شسته شدند. سپس گلوله ها در 1 میلی لیتر بافر هیپوتونیک (250 میلی مولار ساکارز، 3 میلی مولار ایمیدازول، pH 7.4) با مهارکننده های پروتئاز و فسفاتاز و 0.1 میکرولیتر (25 U) DNase (Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis, Thermo-Fi) مجدداً معلق شدند. برای لیز کردن سلول‌ها، از هموژنایزر Dounce در کابینت ایمنی زیستی کلاس II استفاده کردیم (بین 5 تا 7 ضربه تا زمانی که حدود 70 درصد سلول‌ها شکسته شدند). ما لیز را با استفاده از رنگ آبی تریپان در زیر میکروسکوپ مشاهده کردیم. لیزات سلولی در 1200 سانتریفیوژ شدندg در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه برای رسوب دادن هسته ها. سپس مایع رویی پس از هسته I به یک لوله 2 میلی لیتری منتقل شد و دوباره با DNase به مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد تحت درمان قرار گرفت و هسته ها دوباره در دمای 1200 گلوله شدند.g به مدت 5 دقیقه سپس مایع رویی پس از هسته II به یک لوله جدید 2 میلی لیتری منتقل شد و با همان حجم PBS سرد یخ رقیق شد و در 2500 سانتریفیوژ شد.g در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه برای رسوب دادن فاگوزوم ها.

رنگ آمیزی CellVue Claret Far Red (CCFR).

ما از برچسب غشایی CellVue Claret Far Red (CCFR) (Sigma-Aldrich) برای رنگ آمیزی غشای فاگوزوم طبق پروتکل سازنده استفاده کردیم. به طور خلاصه، پلت فاگوزوم را در 50 میکرولیتر رقیق کننده C مجدداً معلق کردیم. سپس 50 میکرولیتر رنگ 4 میکرومولار اضافه شد، مخلوط شد و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. رنگ آمیزی با استفاده از 100 میکرولیتر BSA 1٪ در PBS خاموش شد و دو بار با PBS سرد یخ توسط سانتریفیوژ در 2500 شسته شد.g در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه نمونه ها با 1% PFA در PBS در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه تثبیت شدند و سپس با PBS شستشو شدند. در نهایت، نمونه‌ها را در 1 میلی‌لیتر PBS با 1 میلی‌مولار EDTA برای فلوسیتومتری معلق کردیم.

فلوسیتومتری

برای تجزیه و تحلیل ایمونوفنوتیپ، سلول‌ها با بافر رنگ‌آمیزی فلوسیتومتری در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه مسدود شدند، سپس با آنتی‌بادی مربوطه در رقت 1:100 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند، با PBS شسته شدند و با استفاده از فلوسایتومتر BD Symphony A5 (BD) آنالیز شدند.

سپس نمونه‌ها برای دو مثبت (BFP+ و Claret Far Red+) بر روی BD FACS Aria III مرتب شدند. تحریک BFP روی 399 نانومتر و گسیل در 454 نانومتر و برای Cell Vue Claret Far Red تحریک در 655 نانومتر و گسیل در 675 نانومتر تنظیم شد. استراتژی دروازه‌ای اولیه شامل انتخاب اندازه فاگوزوم باکتریایی و به دنبال آن گیتینگ بر اساس کنترل‌های تک کانالی بود. همه نمونه ها بر اساس کانال دروازه دو مثبت مرتب شدند و تجزیه و تحلیل با استفاده از نرم افزار FlowJo انجام شد.

آماده سازی نمونه برای LC-MS/MS

پس از مرتب سازی، فاگوزوم ها با سانتریفیوژ در 16000 گلوله شدندg به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، مجدداً در PBS همراه با مهارکننده‌های پروتئاز، به لوله‌های میکروسانتریفیوژ با اتصال کم پروتئین منتقل شد. سپس نمونه ها در 50 میکرولیتر بافر لیز (5% SDS و 50 میلی مولار بی کربنات تری اتیل آمونیوم (TEAB) در آب HPLC، pH 7.4) همراه با مهارکننده های پروتئاز (cOmplete, بدون EDTA، Roche) مجدداً معلق شدند. برای آماده سازی نمونه ها برای طیف سنجی جرمی، از ستون های میکرو S-Trap (Protifi) طبق پروتکل بازیابی بالا توصیه شده سازنده استفاده شد. پروتئین ها با 20 میلی مولار تریس (2-کربوکسی اتیل) فسفین در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه کاهش یافت و با 20 میلی مولار یدوااستامید در تاریکی به مدت 30 دقیقه آلکیله شد. سپس پروتئین ها با 5 میکرولیتر اسید فسفریک 55 درصد و 330 میکرولیتر از بافر اتصال S-Trap اسیدی شدند. یک میکروگرم تریپسین اصلاح شده با درجه توالی (Promega) به نمونه های اسیدی شده قبل از انتقال به ستون S-Trap اضافه شد. ستون ها پنج بار با 150 میکرولیتر از بافر اتصال S-Trap شسته شدند قبل از اینکه با 0.5 میکروگرم تریپسین اصلاح شده با درجه توالی در 25 میکرولیتر TEAB 50 میلی مولار، pH 8 به مدت 2 ساعت در دمای 47 درجه سانتی گراد انکوبه شوند. در نهایت، نمونه ها به ترتیب در 40 میکرولیتر 50 میلی مولار TEAB، pH 8، 40 میکرولیتر 0.2 درصد اسید فرمیک و 35 میکرولیتر 50 درصد استونیتریل با 0.2 درصد اسید فرمیک شسته شدند. پپتیدهای شسته شده در یک غلیظ کننده خلاء خشک شده و تا استفاده بعدی در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

طیف سنجی جرمی مستقل اکتساب داده (DIA-MS)

کروماتوگرافی مایع (LC) با استفاده از سیستم Evosep One با ستون 15 سانتی‌متری Aurora Elite C18 با امیتر اسپری بسته یکپارچه (IonOpticks)، در دمای 50 درجه سانتی‌گراد انجام شد. بافر A 0.1٪ اسید فرمیک در آب HPLC، بافر B 0.1٪ اسید فرمیک در استونیتریل بود. بلافاصله قبل از LC-MS، پپتیدها در 30 میکرولیتر بافر A معلق شدند و حجمی از پپتیدها معادل 20 درصد نمونه (100000 رویداد جدا شده در طول FACS) بر روی C18 EvoTips مخصوص سیستم LC بارگذاری شد، بر اساس دستورالعمل های سازنده یا موضوع از قبل مشخص شده بود. پروتکل Whisper-Zoom 20 SPD (که در آن گرادیان 0% تا 35% بافر B، 100 nl/min یا 200nl/min به مدت 58 دقیقه است). Evosep One (EvoSep) همراه با طیف‌سنج جرمی timsTOF-HT (Bruker) استفاده شد که در حالت DIA-PASEF با حساسیت بالا روشن است. محدوده جرم و IM 300-1200 بود متر/z و 0.6-1.45 1/ک₀DIA-PASEF با استفاده از IM- انجام شد.متر/z پنجره های غیر همپوشانی که با استفاده از py_diAID طراحی شده اند [14]، و ارائه می شوند (به بخش اشتراک گذاری داده مراجعه کنید). سطح شیب دار و زمان انباشتگی TIMS 100 میلی ثانیه بود، زمان کل چرخه 1.8 ثانیه بود. انرژی برخورد به صورت خطی اعمال می شود که در آن تحرک یونی = 0.6-1.6 1/ک₀و انرژی برخورد = 20-59 eV.

تجزیه و تحلیل داده های ام اس

فایل های داده خام با استفاده از DIA-NN 1.9 جستجو شدند [60]، با استفاده از او در سیلیکو کتابخانه طیفی تولید شده از انسان خردمند (دانلود شده از Uniprot در 14 سپتامبر 2023، حاوی 42,437 رکورد) و سالمونلا Typhimurium (دانلود شده توسط Uniprot در 14 سپتامبر 2023، حاوی 4659 رکورد) پروتئوم ها و لیست آلاینده های عمومی [61]. کاربامیدومتیلاسیون (C) به عنوان یک تغییر ثابت و اکسیداسیون (M) به عنوان یک متغیر تنظیم شد. توده های اجدادی از 300 تا 1800 با بار 1-4 گنجانده شدند. دقت انبوه برای MS1 و MS2 روی 15 تنظیم شد، تطبیق بین اجراها انجام شد و نرمال سازی روی “Global” تنظیم شد. ویژگی تریپسین روی یک شکاف از دست رفته و نرخ کشف نادرست پروتئین و PSM تنظیم شد.

تجزیه و تحلیل داده های پروتئومی بر روی خط لوله نرم افزار R (v4.2.1) انجام شد. شدت خام log2 تبدیل شد. گروه های پروتئینی شناسایی شده در حداقل چهار نمونه در هر گروه آزمایشی برای تجزیه و تحلیل پایین دست نگهداری شدند. برای برخی از داده‌ها، مقادیر گمشده با روش v2-mnar که در بسته msImpute پیاده‌سازی شده است، وارد شدند. [62] (نسخه 1.7.0). بیان تفاوت بین گروه ها با برازش یک مدل خطی و استفاده از آماره t تعدیل شده تجربی بیز در بسته limma ارزیابی شد. [63] (نسخه 3.60.4). در نتیجه پمقادیر با استفاده از اصلاح بنجامینی-هوچبرگ FDR تصحیح شد. پروتئین ها با تغییر log2 برابر 0.5±≥  و اصلاح شدند صمقدار ≤0.05 به طور متفاوت بیان شده است.

درمان روتنون ماکروفاژهای آلوده

ماکروفاژهای مشتق از مغز استخوان موش (BMDM) از حداقل چهار موش نوع وحشی C57BL/6J در هر آزمایش با استفاده از محیط حاوی L929 جدا شدند. [64,65]. BMDM ها در تراکم 3 × 10 کاشته شدند⁵ در هر چاه یک صفحه 24 چاهی.

نوع وحشی (WT) سالمونلا انتریکا سرووار تیفی موریوم (STM) SL1344 یک شبه در LB مکمل با 100 میلی گرم در میلی لیتر کانامایسین در دمای 37 درجه سانتی گراد و OD کشت داده شد.₆₀₀ برای محاسبه غلظت باکتری ها استفاده می شود. باکتری ها دو بار با PBS شسته شدند و سپس در محیط از قبل گرم شده معلق شدند و BMDM ها با WT STM در تعدد عفونت MOI 20:1 همانطور که در بالا توضیح داده شد آلوده شدند، اما 2 میکرومولار روتنون یا وسیله نقلیه (PBS) با مرحله جنتامایسین اضافه شد. ماکروفاژهای آلوده به STM با استفاده از 1% Triton X-100 لیز شدند و واحدهای تشکیل دهنده کلنی (CFU) روی صفحات کانامایسین آگار یک شبه تعیین شدند.

جداسازی از سالمونلاحاوی واکوئل (SCV) توسط اولتراسانتریفیوژ

جداسازی SCV ها همانطور که در بالا توضیح داده شد انجام شد [8,66]. تقریباً 5 × 107 سلول THP-1 آلوده به اس. تیفی موریوم SL1344 در هر نقطه زمانی جمع آوری شد، پردازش و اولتراسانتریفیوژ شد.

سلول ها سه بار با PBS سرد یخ شسته شدند، به آرامی در لوله های سانتریفیوژ 15 میلی لیتری با استفاده از یک لیسه لاستیکی خراش داده شدند و در 300 گلوله شدند.g به مدت 4 دقیقه گلوله ها مجدداً در بافر همگن سازی سرد یخی (250 میلی مولار ساکارز، 20 میلی مولار HEPES pH 7.2، 0.5 میلی مولار EGTA و کوکتل بازدارنده پروتئاز) معلق شدند. [Roche]) و به هموژنایزر Dounce منتقل می شود. سلول ها بر روی یخ با استفاده از یک دسته محکم (30 ضربه) لیز شدند تا اینکه 90٪ اختلال بدون شکست هسته ای به دست آمد، همانطور که توسط رنگ آمیزی تریپان بلو در زیر میکروسکوپ کنتراست فاز ارزیابی شد.

سلول ها و هسته های دست نخورده با سانتریفیوژ در 1000 حذف شدندg به مدت 10 دقیقه و مایع رویی حاصل (روی پس از هسته، PNS) جمع آوری شد. PNS روی 39 درصد ساکارز بافر تنظیم شد و روی یک گرادیان ساکارز ناپیوسته متشکل از 55 درصد ساکارز بر روی یک بالشتک ساکارز 65 درصد و به دنبال آن لایه‌های 32.5 درصد و 10 درصد ساکارز در یک لوله اولتراسانتریفیوژ باز 13.2 میلی‌لیتری قرار گرفت. تمام محلول های ساکارز (w/v) در 20 میلی مولار HEPES (pH 7.2) و 0.5 میلی مولار EGTA تهیه شد.

لوله های گرادیان آماده شده در یک روتور سطلی دوار در 100000 سانتریفیوژ شدند.g به مدت 1 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد فراکسیون‌ها (هر کدام 1 میلی‌لیتر) از بالا به پایین جمع‌آوری شدند و 1-13 برچسب‌گذاری شدند. فراکسیون های 8-10 ادغام شدند، به ساکارز 11 درصد با بافر همگن بدون ساکارز رقیق شدند و روی بالشتک فیکول 15 درصد (ساکارز 5 درصد، EGTA 0.5 میلی مولار، HEPES 20 میلی مولار، pH 7.2) لایه لایه شدند.

نمونه ها در 18000 سانتریفیوژ شدندg به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد (روتور SW41Ti). مایع رویی دور انداخته شد و گلوله مجدداً در 11 میلی لیتر بافر همگن سازی معلق شد و سپس سانتریفیوژ دوم در 18000 انجام شد.g به مدت 20 دقیقه گلوله نهایی به عنوان بخش SCV برچسب گذاری شد، در بافر لیز معلق شد و برای تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی همانطور که در بالا توضیح داده شد پردازش شد.